蛋白酶抑制劑的選擇 應用 使用 方法 說明

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羅氏蛋白酶抑制劑&磷酸酶抑制劑

cOmplete 是多種蛋白酶抑制劑的混合片劑：為水溶性片劑；同時持續(xù)抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等在內(nèi)的多種蛋白酶；可用于所有的組織及細胞，如動物、植物、酵母、細菌或真菌。

PhosSTOP 保護蛋白質(zhì)不發(fā)生去磷酸化反應；可以抑制多種磷酸（酯）酶；適用于在細胞裂解過程中保護蛋白質(zhì)，并且可以適用于多種不同來源的樣品（哺乳動物，植物，酵母）；可以結(jié)合cOmplete Lysis Kits 和 cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets一起使用；這種抑制劑藥片可用于緩沖福爾馬林（福爾馬林固定術(shù)）。

當細胞破碎的時候，蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活，使電泳結(jié)果復雜化，影響終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時盡可能在低溫下進行。此外，許多蛋白酶在pH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。

但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時應當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來說，選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線設計來說顯得尤為重要。

蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣，都是紛繁復雜的，通常使用許多化學物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑，如PMSF 和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常建議復合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”，見下表（來自《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》）。

其實重要的是這種片劑操作方便：只要將一片completeTM 加進緩沖液，便可抑制多種不同的蛋白酶，有效地保護目的蛋白，效果明顯，免除了稱量個別抑制劑的麻煩。而且complete Lysis 1個Kit20次反應，定價為2167（Complete Lysis, bacterial II，其它類型價格差不多），高品質(zhì)，價格也不高，一舉兩得，何樂而不為呢？

另外MERCK在抑制劑生產(chǎn)提供方面也實力雄厚，旗下的各*有一千多種不同用途的抑制劑用于信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、蛋白質(zhì)組、細胞分化、神經(jīng)生物等諸多領(lǐng)域。其中也包含了分別適用于細菌、植物、酵母、哺乳動物細胞、重組蛋白、His融合蛋白等不同目的的蛋白酶抑制劑混合物，特異性抑制絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶活性的抑制劑混合物、堿性磷酸酶抑制劑混合物、酸性及堿性蛋白酶抑制劑混合物等等。

比如用于廣譜蛋白抑制的Protease Inhibitor Cocktail Set I是五種蛋白酶抑制的混合物，廣泛抑制多種不同蛋白酶及酯酶的活力，以凍干粉形式提供（每管以1ml水重溶，即可得1ml的100ⅹ儲液），方便保存。其它有針對性的蛋白酶抑制劑還有Protease inhibitor cocktail set II（細菌）、Protease inhibitor cocktail set III, EDTA-free（哺乳動物細胞和組織）、protease inhibitor cocktail set IV（酵母及真菌）、Protease inhibitor cocktail set V, EDTA-free（哺乳動物細胞和組織廣譜絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶抑制劑）、Protease inhibitor cocktail set VI（植物）和Protease inhibitor cocktail set VII（His融合蛋白純化 ）。種類繁多，合適于有不同要求的實驗人員。

除此之外，G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各種經(jīng)過濃度優(yōu)化后的蛋白酶抑制劑，具有良好的抑制廣泛物種蛋白純化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已經(jīng)發(fā)展成為大規(guī)模制備型，具有50ml和100ml的裂解緩沖液中使用的兩種規(guī)格。ProteCEASE分含有EDTA型，用于抑制金屬蛋白酶（metalloprotease）；和不含有EDTA型，用于維持依賴于二價陽離子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不會影響使用固相親和層析的蛋白純化，這種方便的形式具有強烈的蛋白抑制作用。

AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通過磺酰化蛋白酶活性中心的一個基團，不可逆地抑制凝血酶thrombin和其他一些絲氨酸蛋白酶（chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin）。這種試劑是PMSF和DFP的低毒替代品，具有較高的水溶性，溶液狀態(tài)的pH為酸性，所以在這種pH下，穩(wěn)定性較高。

除了蛋白酶抑制劑以外，在許多研究過程中，尤其是一些制藥公司和研究院在研究藥理學機制的時候，需要了解蛋白磷酸化途徑，因此一個重要的步驟就是準確的觀察一般和特異的磷酸化狀態(tài)，所以蛋白抽提的另一個重要保護過程就是對磷酸化狀態(tài)的有效保護。

磷酸化的蛋白可以被非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或雙重特異性磷酸酶去磷酸化。針對這種情況羅氏也推出了一種PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合片（可以與complete蛋白酶抑制劑兼容），這是一種即用型的片劑，其中的一些磷酸酶抑制劑只需要納摩爾級的量。無需花費漫長的時間尋找合適的磷酸酶，也不必繁瑣的稱量和混合。PhosSTOP可同時持續(xù)抑制包括酸性和堿性磷酸酶，及絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在內(nèi)的多種磷酸酶。

而且PhosSTOP可應用于多種細胞提取物中磷酸酶的抑制作用，包括對酸性和堿性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP也不會影響后繼的蛋白檢測（例如：western blot）或是蛋白濃度檢測 （例如：BCA或是Bradford）。

當然提到磷酸酶抑制劑或者蛋白酶抑制劑，一個業(yè)內(nèi)*的做得相對不錯的就是默克了，它的磷酸酶抑制劑混合物是以DMSO貯存液的形式，擺脫繁瑣的操作步驟，節(jié)約成本和時間，在效果方法能有效抑制劑蛋白樣本中的各種磷酸酶（酸性/堿性磷酸酶、絲/蘇氨酸磷酸酶、酪氨酸磷酸等），配方*公開，便于研究人員靈活應用。

旗下產(chǎn)品包括：可抑制酸性磷酸酶、堿性磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，可抑制絲/蘇氨酸磷酸酶及酪氨酸磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set III，以及可抑制絲/蘇氨酸磷酸酶及堿性磷酸酶的Phosphatase Inhibitor Cocktail Set IV。

總而言之，在實驗中適當?shù)倪x擇一些經(jīng)過嚴格的質(zhì)量監(jiān)控的產(chǎn)品，想來相比較于家制的雞尾酒而言具有更好的使用重復性，和有效性，讓我們在下游應用中得到更潔凈和清晰的結(jié)果。

但是這樣配置溶液進行處理，有時也是頗為麻煩，而且效果可能并不好，目前有一些廠家試劑在簡便操作，和抑制效果方面有不俗的表現(xiàn)，可以考慮在實驗中選用，節(jié)約時間和便于結(jié)果分析。

比如，羅氏的Complete蛋白酶抑制劑混合片也許就能滿足這種需要，這種試劑能抑制很多種不同的蛋白酶，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等，而且可應用于差不多所有的組織或細胞提物，包括來自動物、植物、酵母、細菌和直菌的樣品。

除此之外，Complete蛋白酶抑制劑混合片所有成份都穩(wěn)定和無毒，能提供安全和可靠的保護，這種混和片有不含EDTA的配方，這樣就更不會影響依賴金屬的蛋白的活性，并可確保有效進行一些純化工作（如應用Poly-His）標記的蛋白）。